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 I - DESCRIÇÃO:

A ação anti proliferativa do produto Green Sap foi avaliada sobre células de linfoma murino BW5147 in vitro mediante curvas doses-resposta e a distintos tempos de exposição a ditos produtos, no cultivo das mesmas na presença e ausência do dito extrato vegetal, de seus componentes individuais e do veículo. A resposta proliferativa foi determinada mediante a técnica de incorporação de [3H]- timidina ([3H]-TdR) ao ADN celular e posterior avaliação da radioatividade nuclear por espectrometria de cintilação líquida.

II - ESPECIFICAÇÃO DA METODOLOGIA:

1 - Extratos Vegetais:

 Os extratos vegetais avaliados correspondem a seguinte descrição:

• Tintura Mãe (TM): Corresponde a uma tintura constituída pela união de três tinturas individuais, a saber: tintura de Baccharis40% v/v; tintura de Rosimarinus 40 % v/v e tintura de Plantago20% v/v. O conteúdo alcoólico da tintura mãe é de 50%.

• Produto final 1 (PF1) ou Green Sap: Corresponde a uma diluição 1/10 da tintura mãe em água (tintura de Baccharis 4% v/v: tintura de Rosamarinus 4% v/v, tintura de Plantago 2% v/v e contendo álcool de 5% v/v).

• Produto final 3 (PF3): Corresponde a uma diluição 1/10 da tintura mãe, com um agregado de álcool até uma concentração final de 15% v/v.

2 - Linha de linfoma murino:

 A linha empregada corresponde a um linfoma T murino, denominado BW5147, proveniente de um tumor espontâneo de ratos AKR/J adaptado a cultivo, originado nos Laboratórios Jackson, USA. O mesmo é sensível a cortisol(10-6 M) e expressa o haplotipo H-2k e os seguintes marcadores: CD3+, receptor T ab e Thy 1.1, os que são rotineiramente checados por citometria de fluxo com anticorpos monoclonales específicos.

3 - Condições de cultivo e avaliação da proliferação celular:

As células BW5147 (3-5 X 105 cel/ml) se cultivaram em médiaRPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 2 mM de glutaminaem presença dos antibióticos penicilina (100U/ml) e estreptomicina (10µg/ml), em placas de 96 pocillos (volume final 0.2 ml),em condições de esterilidade (fluxo laminar, Steril Guard Hood classe II, Type a/B3; marca: Baker Company, modelo: SG-400m), e em ambiente gazeado com 5% de CO2 ( estufa gazeada de CO2: marca: Forma Scientific: modelo: 3111). Realizaram-se cultivos com concentrações crescentes dos extratos vegetais já mencionados durante 24, 48 e 72hs de incubação. As células foram pulsadas com 0,75 µCi/pocillo de [3H] TdR (S = 25 Ci/mmol) 16hs antes do sacrifício dos cultivos (por congelamento a -20°C).

Os cultivos foram posteriormente descongelados e filtrados por filtros de fibra de vidro, Whatmann GF/A. A [3H]-TdR incorporada ao ADN nuclear e retida em ditos filtros quantificou-se por espectrometria de cintilação liquida empregando cocktails de cintilação comerciais. Os resultados (obtidos em dpm) expressarão se como Porcentagem de Inibição (Inib %) considerando como 100% as dpm obtidas em ausência de extrato e/ou presença do veiculo.

 4 - Determinação da viabilidade celular:

A viabilidade celular a distintos tempos em presença ou ausência de TM e PF foi avaliada mediante contagem celular microscópico na câmara de Neubauer, empregando um colorante de exclusão, o Azul Tripán. As % de viabilidade correspondente se calculou tendo em conta a quantidade de células vivas (que não incluem o colorante de exclusão) com respeito ao total de células (Vivas + Mortas, é dito aquelas células que incorporam o colorante e se vêem a cor azul na observação microscópica).

 5 - Análises estatísticas dos resultados:

Os resultados foram analisados mediante o Test de Student y Analises de Varianza seguida do teste de Dunnetpara determina as diferenças significativas entre grupos. Os valores se consideraram estatisticamente significativos quando p £ 0.05.

III - RESULTADOS

•  Ação anti proliferativa doses-respostas dos extratos vegetais sobre as células BW5147 nas 24 hs de cultivo:

TABELA 1: porcentagem de inibição da proliferação de células de linfoma T induzida por concentrações crescentes de Green Sap, da sua tintura mãe e de PF3, nas 24hs de cultivo.

a. Se empregaram diluições correlativas de TM e PF de acordo com sua proporção na TM. O volume total da diluição de produtos vegetais agregados foi de 0.02 ml, máximo volume que pode ser agregado sem que dilua o aporte de nutrientes no médio do cultivo. Cabe assinalar que por este motivo não se pode avaliar (N.D. = não determinado) a diluição de PF1 e PF3 (1/25) equivalente à diluição 1/25 de TM.

b. As porcentagens de inibição foram calculados considerando como 100% a radiatividade de [3H]-Tdr incorporada nos cultivos basais (é disser, em ausência de produto vegetal): 24024 ± 1206 dpm. Cabe assinalar que a presença de 1.5 e 2 % do veículo alcoólico (conteúdo alcoólico da diluição 1/25 do PF3 e da TMrespectivamente) estimula a proliferação celular em 25% aproximadamente. Todas as outras diluições de extratos vegetais foram realizadas mantendo uma concentração final constante de álcool de 0.5% que não afetou a proliferação basal. Os resultados mostrados são a média E.S. de n=5 experimentos realizados por triplicado.

* Difere significativamente do basal com p £ 0.01

# Difere significativamente do basal com p £ 0.05

• Ação doses resposta das tinturas individuais sobre a proliferação das células BW5147 e nas 24hs de cultivo:

TABELA 2: Efeito de concentrações crescentes das tinturas individuais sobre a proliferação de células BW5147

a. Cada extrato de tintura individual se diluiu em meio do cultivo contendo uma concentração final de álcool de 50% e nas mesmas proporções que as contidas na TM. Em cada placa se realizou um controle positivo correspondente a diluição 1/25 de TM com a que se obteve em todos os casos um % Inibição ³94%.

b. As porcentagens de inibição mostradas são a média ± ES de n= 2 determinações realizadas por triplicado e foram calculados como se explicou anteriormente.

* Difere significativamente do basal com p £ 0.01

# Difere significativamente do basal com p £ 0.05

• Ação anti proliferativa doses resposta dos extratos vegetais sobre as células BW5147 nas 48hs de cultivo:

TABELA 3: Porcentagem de inibição da proliferação de células de linfoma T induzida por concentração crescente de Green Sap, da sua tintura mãe e de PF3, nas 24hs de cultivo.

• Empregaram-se as diluições correlativas de TM e PF tal como se descreveu anteriormente.
• As porcentagens de inibição foram calculadas tomando como 100% a radiatividade de [3H]-Tdr incorporada nos cultivos basais: 32360 ± 1165 dpm. Nas 48hs de cultivo se observaram diferenças significativas com 1.5% e 2% do veículo alcoólico (diluição 1/25 de PF3 e TM, respectivamente) respeitando a proliferação basal. Todas as outras diluições de extratos vegetais foram realizadas mantendo uma concentração final constante de álcool de 0.5% que também não afetaram a proliferação basal. Os resultados mostrados são em média ± E.S. de n=5 experimentos realizados por triplicação.

* Difere significativamente do basal com p £ 0.01

# Difere significativamente do basalcom p £ 0.05

• Ação anti proliferativa doses resposta dos extratos vegetais sobre as células BW5147 nas 72hs de cultivo.

TABELA 4: Porcentagem de inibição doses resposta induzida por Green Sap, sua tintura mãe e PF3 sobre a proliferação de células de linfoma T nas 72hs de cultivo.

a. Se empregaram as diluições correlativas de TM e PF como se descreveu anteriormente.

b. As porcentagens de inibição foram calculadas tomando como 100% a radiatividade de [3H]-TdR incorporada nos cultivos basais: (16781 ± 1188) dpm. Em todas as diluições se manteve um 0.5% de conteúdo alcoólico que não modificou a proliferação basal.

Os resultados mostrados são por média ± E.S. de n=5 experimentos realizados por triplicado. * Difere significativamente do basal com p £ 0.01. #Difere significativamente do basal com p £ 0.05.

• Ação dos extratos vegetais sobre a viabilidade de células BW5147 a distintos tempos de cultivo:

TABELA 5: Efeito de TM e PF3 sobre a viabilidade de células em cultivo nos distintos tempos de estudo.

a. Os % de viabilidade a cada tempo (média± ES de n=3 experimentos) se calcularão tendo em conta a quantidade de células vivas (que não incluem o colorante de exclusão Azul Tripán)com respeito ao total de células (Vivas + mortas: células que incorporam o colorante e se vêem de cor azul em observação microscópica). Os resultados se compararam com os valores médios correspondentes aos basais e as células incubadas pelos mesmos tempos em média com 0.5% de álcool, os que se detalham na continuação (95.3 ± 1.2) %, (94.0 ± 1.4) % e (94.3 ± 1.0)% nas 24, 48 e 72hs, respectivamente.

* Diferem significativamente dos valores basais com p £ 0.01

# Diferem significativamente dos valores basais com p £ 0.05

CONCLUSÕES:

• Observa-se um infecto inibitório (Fig. 1-3, Tabelas 1, 3 e 4) da proliferação de células do linfoma T murino BW5147 induzido pelos produtos vegetais TM, PF1 e PF3. Dito efeito é concentração dependente. Observa-se nos três tempos estudados, 24, 48 e 72hs de cultivo. No máximo nas 48hs de cultivo para as doses mais altasse vê uma potenciação as 72hs do cultivo dos efeitos induzidos pelas diluições maiores. Neste tempo tem que considerar sem embargo a possível contribuição de mecanismo de inibição por contato entre as células em cultivo as que se duplicam cada 12-14 hs (Cremaschi et al, J. Neuroimmunol, 2000, 110: 57).
• Tem-se encontrado concordância entre os efeitos exercidos pelos PF e pela TM, nos três tempos estudados.
• A avaliação dos efeitos dos extratos das tinturas individuais diluídas e ensaiadas nas mesmas proporções que as contidas na TM, permite verificar um efeito sinérgico dos três componentes (Tabela 2, Fig. 4).
• A observação microscópica com um colorante de exclusão permite inferir que tanto PF como TM tem um efeito citostático nas 24hs já que não modificaram significativamente a viabilidade celular, sem embargo com o tempo pareceria dar-se também um efeito cito tóxico em que não se pode descartar a participação de outros fatores inerentes ao cultivo celular (Tabela 5, Fig. 5 e 6).

Conclusão Final: tanto as TM como seus PF exercem um efeito anti proliferativo contundente sobre o linfoma TBW5147 que justifica prosseguir com a avaliação da ação dos mesmos sobre o comportamento biológico do linfoma In Vivo.